Dentro de las células ocurren miles de procesos mediante los cuales se reconocen moléculas, se metabolizan y se almacenan en organelos con el fin de mantener el funcionamiento celular en buenas condiciones. Poder determinar la localización de estas moléculas dentro de la célula o cuáles son las vías por las que se transportan es un objetivo común dentro de la investigación en bioquímica y biología molecular para poder explicar procesos complejos, como el metabolismo de azúcares o la señalización celular. El reto es diseñar y aplicar los métodos que permitan la detección de estas moléculas de interés.
Una de las estrategias ampliamente usadas es el de los sensores basados en FRET, por su nombre en inglés “Förster resonance energy transfer”, es decir, Transferencia de Energía de Resonancia Förster. A grandes rasgos, la FRET consiste en la transmisión del exceso de energía de una molécula excitada, conocida como donador, hacia una molécula no excitada, llamada aceptor.1 Durante esta transferencia se provocan cambios en la fluorescencia de las moléculas, que pueden ser detectados mediante un microscopio apropiado. La condición para que esto ocurra es que, tanto el donador como el aceptor, estén suficientemente cerca uno del otro.
Con el uso de esta propiedad, los investigadores pueden diseñar estructuras que funcionan como detectives moleculares que reconocen moléculas específicas de interés en cada investigación. Al reconocer la molécula blanco, el donador y el aceptor se acercan lo suficiente y se lleva a cabo la transferencia de energía.
Imaginemos a los sensores FRET como una pinza de ropa. Cuando la molécula de interés se une al sensor, en la parte de presión en la pinza, los brazos inferiores, donde se localizan las moléculas aceptora y receptora, se acercan, provocando un cambio de fluorescencia y advirtiendo a los investigadores que la molécula de interés está presente (Fig. 1A). Sin embargo, también es posible que el donador y el receptor se localicen en los brazos superiores de la pinza, provocando que, al unirse la molécula de interés, se deje de emitir fluorescencia (Fig. 1B). Esto dependerá de la configuración del sensor que el investigador elija.
Figura. Representación de un sensor FRET de glucosa
A través de los sensores FRET fue posible el hallazgo de una nueva familia de proteínas transportadoras de azúcares en plantas llamadas SWEET (por sus siglas en inglés, Sugars Will Eventually be Exported Transporters).2 Estos transportadores son muy relevantes para las plantas, ya que permiten que los azúcares sintetizados en las hojas durante la fotosíntesis lleguen a otras partes de las plantas que necesitan de ellos, pero son incapaces de sintetizarlos, como las flores, los frutos, las semillas o las raíces. Incluso los SWEET son necesarios para que los microorganismos asociados a las plantas, como algunos hongos simbiontes, puedan ser alimentados.3 Antes del descubrimiento de los SWEETs era poco claro cómo estos procesos vitales se llevaban a cabo, a pesar de que otros tipos de transportadores ya se conocían. Las plantas tienen numerosos genes que codifican diferentes SWEET: en la soya hay 52,4 en el maíz hay 24,5 pero en el humano sólo se tiene un gen.
Los investigadores que descubrieron a los SWEETs en 20106 usaron un tipo de células especiales conocidas como HEK, las cuales internalizan nula cantidad de glucosa por ellas mismas aunque se encuentren en un medio rico en esta azúcar. En estas células, mediante técnicas de biología molecular, los investigadores expresaron sensores FRET especiales para el reconocimiento de glucosa dentro de la célula como el ilustrado en la figura 1B. Como se esperaba, no se detectaron cambios en la fluorescencia emitida por el sensor, ya que había insuficiente glucosa dentro de dichas células. Posteriormente, los investigadores expresaron en esas mismas células un gen de planta, cuya función y proteína codificada eran desconocidas. Fue entonces cuando observaron una disminución en la fluorescencia gracias al sensor FRET, por lo que concluyeron que este gen desconocido codifica para una proteína que permite el transporte de la glucosa hacia el interior celular.
Debido a que se pueden hacer diseños muy específicos de sensores FRET altamente configurables, son ampliamente usados en múltiples líneas de investigación, como en el metabolismo durante enfermedades cardiovasculares o en el cáncer.7 También han sido usados para el monitoreo en tiempo real de la acción de fármacos en sitios específicos, como órganos, tejidos e incluso en compartimentos celulares, ya que la resolución alcanzada puede ser a nivel de una sola célula.8
Los métodos de imagenología para la detección de cáncer más usados son los rayos X, la tomografía computarizada, la imagen de resonancia magnética, el ultrasonido y la endoscopía. Sin embargo, estos métodos sólo pueden identificar al cáncer una vez que una anormalidad en el tejido es visible, y no discriminan los tumores malignos de los benignos.9
Gracias a la investigación en ciencia básica, es bien sabido que los tejidos humanos sanos tienen un pH de 7.2 a 7.4, mientras que las células de ciertos tumores y el ambiente circundante de los tejidos generalmente es más ácido, con un pH de 5.5 a 6.5 en el cáncer de mama,10 cáncer cervical, osteosarcoma y melanoma.11 Con esto en mente, se han podido diseñar sensores FRET que reportan el cambio de pH celular, como el que recientemente construyeron Koushik Bhattacharya y colaboradores,12 en donde, dentro de células normales, la “pinza” del sensor acerca las molécula donadora y aceptora a 3.4 nm, haciendo que la molécula aceptora emita fluorescencia. Mientras que, al interior de células anormales, la pinza del sensor aleja las moléculas reporteras a 10 nm, debido al pH ácido, por lo que sólo la molécula donadora emite fluorescencia muy baja.
El desarrollo de este tipo de sensores requiere un arduo trabajo de investigación. Primero, para poder identificar factores clave que indiquen el inicio de un cáncer (ya que la detección temprana está asociada a mejores tasas de supervivencia); en segundo lugar, y no menos relevante, para generar bibliotecas de moléculas donadoras y aceptoras, así como las que forman la pinza del sensor, con diferentes características que puedan ser aprovechadas en el diseño específico de acuerdo al tipo de cáncer que se aborde.
Otra aplicación reciente de los sensores FRET es en la detección de moléculas dañinas para la salud. La acrilamida es una molécula cancerígena que se forma en la comida durante su procesamiento a más de 120°C. Tradicionalmente es detectada en muestras de alimentos mediante técnicas que implican el uso de equipo costoso, como la cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) y la cromatografía de gases (GC). En el Instituto de Tecnología Rourkela, India, un grupo de investigadores desarrolló un sensor FRET que puede detectar la acrilamida con una alta precisión y de una manera menos costosa y más rápida, 10 minutos, en comparación con la detección mediante HPLC que es de 60 minutos.13
El uso de técnicas de biología molecular es cada vez más asequible y promete el desarrollo de pruebas diagnósticas precisas y eficaces. Para que sea posible, la investigación en ciencia básica y la disponibilidad de bases de datos robustas son esenciales para el desarrollo de herramientas especializadas como los sensores FRET.
Montserrat López-Coria.
Bióloga egresada de la FES Iztacala, UNAM. Doctora en Ciencias por la Facultad de Química, UNAM.
1 Jones, G. A., y Bradshaw, D. S., “Resonance Energy Transfer: From Fundamental Theory to Recent Applications”, Front. Phys., 7, 2019.
2 Chen, L. Q., y otros. “Sugar transporters for intercellular exchange and nutrition of pathogens”, Nature 468, 2010, pp. 527–532.
3 Breia, R., y otros. “Plant SWEETs: from sugar transport to plant–pathogen interaction and more unexpected physiological roles”, Plant Physiol. 186, 2021, pp. 836–852.
4 Ibid.
5 Ibid.
6 Bhattacharya, K., y otros. “Glycopolymer Decorated pH-Dependent Ratiometric Fluorescent Probe Based on Förster Resonance Energy Transfer for the Detection of Cancer Cells”, 2022.
7 Le, T.-H.; Lee, H.-J., y Tran, Q.-N. “Glutathione Fluorescence Sensing Based on a Co-Doped Carbon Dot/Manganese Dioxide Nanocoral Composite”, Materials (Basel). 15, 2022.
8 Potekhina, E. S., y otros. “Drug Screening with Genetically Encoded Fluorescent Sensors: Today and Tomorrow”, Int. J. Mol. Sci. 22, 2021.
9 Pramod, P. S.; Shah, R., y Jayakannan, M. “Dual stimuli polysaccharide nanovesicles for conjugated and physically loaded doxorubicin delivery in breast cancer cells”, Nanoscale, 7, 2015, 6636, 2015
10 Justus, C. R., y otros. “Acidic tumor microenvironment and pH-sensing G protein-coupled receptors”, 2013.
11 Pramod, P. S.; Shah, R., y Jayakannan, M. ob. cit.
12 Bhattacharya, K., y otros, ob. cit.
13 Pattnayak, B. C., y Mohapatra, S. “A smartphone-assisted ultrasensitive detection of acrylamide in thermally processed snacks using CQD@Au NP integrated FRET sensor”, Spectrochim. Acta Part A Mol. Biomol. Spectrosc. 286, 122009, 2023.